染雾细菌电泳相关论文范文 篇一
标题：细菌电泳技术的原理与应用
引言：
细菌电泳作为一种广泛应用于细菌学研究的技术，近年来受到了越来越多的关注。它通过利用细菌的电荷特性，在电场作用下使其在凝胶中移动，从而实现对细菌的分离、鉴定和分析。本文将介绍细菌电泳技术的原理、方法以及其在细菌学研究中的应用。
一、细菌电泳的原理
细菌电泳的原理基于细菌带电性质和凝胶电泳技术。细菌在电场下会受到电荷的作用，带正电的细菌向阴极迁移，带负电的细菌向阳极迁移。而凝胶电泳技术则是通过将细菌样品置于凝胶中，利用凝胶的孔隙结构和电场的作用，实现对细菌的分离和鉴定。
二、细菌电泳的方法
细菌电泳的方法主要包括脉冲电泳和连续电泳两种。脉冲电泳是指在电场中应用脉冲电压，使细菌在电场中快速迁移，以实现分离和分析。连续电泳则是指在恒定电场下进行电泳分离，常用于细菌的鉴定和定量分析。
三、细菌电泳的应用
1. 细菌鉴定：细菌电泳可以通过细菌的电泳图谱来鉴定和分类细菌。每种细菌在电泳图谱中有独特的迁移模式和带电特征，可以用于鉴定和区分不同的细菌。
2. 细菌分离：细菌电泳可以将混合细菌样品进行分离，从而得到纯净的单个细菌菌株。这对于研究细菌的生理特性、遗传变异等具有重要意义。
3. 细菌遗传分析：细菌电泳可以用于细菌的遗传分析，例如测定细菌的基因型和基因频率分布等。通过分析细菌电泳图谱的差异，可以揭示细菌的遗传关系和进化过程。
结论：
细菌电泳作为一种快速、准确、可靠的细菌分离和鉴定技术，在细菌学领域发挥着重要的作用。它不仅可以帮助科研人员深入研究细菌的生理特性和遗传变异，还可以应用于医学、食品安全等领域的细菌检测和鉴定。因此，细菌电泳技术具有广阔的应用前景。
细菌电泳相关论文范文 篇二
标题：细菌电泳在食品安全领域的应用研究
引言：
食品安全一直是人们关注的重要问题，细菌污染是引起食品安全问题的主要原因之一。传统的细菌检测方法通常耗时长、操作复杂，无法满足快速检测的需求。细菌电泳作为一种快速、准确的检测技术，近年来在食品安全领域得到了广泛应用。本文将介绍细菌电泳在食品安全领域的应用研究进展。
一、细菌电泳在食品样品中的应用
细菌电泳可以应用于各类食品样品的细菌检测，如肉类、水产品、乳制品等。通过对食品样品进行细菌电泳分析，可以快速鉴定和定量分析其中的细菌污染情况，为食品安全监管提供科学依据。
二、细菌电泳在食品工业中的应用
细菌电泳可以应用于食品工业中的细菌检测和控制。通过对生产环境、生产设备和原料进行细菌电泳分析，可以及时发现细菌污染源，采取相应的控制措施，确保食品的安全和质量。
三、细菌电泳在食品检疫中的应用
细菌电泳可以应用于食品检疫中的细菌检测。通过对进口和出口的食品样品进行细菌电泳分析，可以及时发现潜在的细菌污染问题，避免食品安全风险的传播和扩大。
四、细菌电泳在食品追溯中的应用
细菌电泳可以应用于食品追溯中的细菌溯源。通过对食品样品中的细菌电泳图谱进行比对和分析，可以确定细菌的来源和传播途径，为食品追溯和溯源提供科学依据。
结论：
细菌电泳作为一种快速、准确的细菌检测技术，在食品安全领域具有广泛的应用前景。它可以提高食品安全监管的效率，保障公众的饮食安全。随着技术的不断发展和完善，相信细菌电泳技术将在食品安全领域发挥更大的作用。
细菌电泳相关论文范文 篇三
肝癌的生物治疗
【摘要】 生物 治疗 作为肿瘤治疗的新概念备受关注，已成为继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的第4种模式。随着 现代 分子生物学技术和基因工程技术的迅速 发展 ，为原发性开辟了全新的领域，并已取得了越来越多可喜的成果，分子靶向治疗、免疫治疗、基因治疗、内分泌治疗、干细胞治疗等显示出了良好的应用前景。就生物治疗在肝癌治疗中的研究和应用作一概述。
【关键词】 肝肿瘤·生物治疗
原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PLC)中90%为肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。随着现代分子生物学技术和基因工程技术的迅速发展，为PLC的生物治疗开辟了全新的领域，生物治疗已成为继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的第4种模式，并显示出了良好的应用前景。主要包括：分子靶向治疗、免疫治疗、基因治疗、内分泌治疗、干细胞治疗等。
1 、分子靶向治疗
HCC的发病机制十分复杂，其发生、发展和转移与多种基因的突变、细胞信号传导通路和新生血管增生异常等密切相关，其中多个关键性环节，是进行分子靶向治疗的理论基础和重要的潜在靶点。分子靶向药物治疗PLC已成为新的研究热点。靶向治疗是将免疫分子、分子受体或脂质体等载体，与药物、放射性核素或生物毒素等偶联，靶向性杀伤肿瘤细胞。
针对表皮生长因子及其受体的靶向治疗
表皮生长因子(epidernal growth factor，EGF)是生长因子家族的主要成员之一，是含53个氨基酸残基的多肽激素。EGF可以强烈刺激细胞分裂，与胚胎的发生与生长、组织的修复与再生以及肿瘤的发生有密切的关系。EGF及其受体(EGFR)在PLC中存在过表达[1]，与PLC的形成、发生、发展有密切关系[2-4]。抗EGFR药物如埃罗替尼(erlotinib)和西妥昔单抗(cetuximab)，能够靶向性作用于肿瘤细胞表面的EGFR，有效阻断由EGFR介导的下游信号传导通路和细胞学效应，并诱导EGFR内化和降解。但近年多项临床研究显示，抗EGFR治疗对PLC患者的疗效并不显著[5]，因而抗EGFR治疗在HCC的治疗上尚存在一定争议。
抗血管生成治疗
肿瘤生长、代谢、浸润转移和复发均与肿瘤的血液供应密切相关。PLC是一种富血管的恶性肿瘤，恶性程度高、生长速度快、转移范围广、复发率高。目前已证实肿瘤患者体内存在多种血管生成因子，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是体内作用最强的一种血管生成因子[6]。PLC患者VEGF血清水平显著的高于肝脏良性病变患者和正常人群[7]。缺氧是VEGF最强烈的诱导剂[8]，由于肿瘤细胞在不断生长过程中对氧的需要不断增加，而肿瘤周围组织供氧量有限，因此导致肿瘤分泌大量VEGF，不断促使新生血管生成，以满足肿瘤生长的需求。此外，VEGF诱导新生的肿瘤相关血管结构不完善且通透性强，部分肿瘤细胞可以穿过血管壁进入血管向远处转移，故加速了肿瘤浸润和转移[9]。在PLC患者中，己发生转移的患者VEGF血清水平也较未发生转移的患者显著增高[9]。因此，VEGF在PLC的生长、浸润、转移、治疗和提示预后方面都有重要的作用。近年来，抗血管生成治疗在 HCC的治疗中占据了越来越重要的地位。目前临床上应用最广泛的抗血管生成药物包括VEGFxxx贝伐单抗(bevacizumab，Avastin)和Brivanib等。贝伐单抗是一种新型的抗VEGF的人源化单克隆抗体，可结合VEGF并防止其与内皮细胞表面的受体(Flt-1和 KDR)结合而发挥作用、减少肿瘤内的血管形成，从而使肿瘤组织无法获得生长、增殖所需的血液、氧及其他养分，最终导致肿瘤坏死。近年来，有学者将贝伐单抗用于不能手术和介入治疗的晚期HCC患者，取得了较好的效果[10]。
信号传导通路xxx治疗
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian targetof rapamycin，mTOR)是哺乳动物磷脂酰肌醇/蛋白激酶(PI3k/Akt)通路的下游效应物，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，mTOR通过调节其他激酶，如40S核糖体6激酶(S6k)，细胞周期依赖蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDK) 和真核细胞翻译起始因子(4E结合蛋白，4EB) 的磷酸化，在蛋白质翻译过程中起重要调节作用。虽然与 mTOR有关的信号传导途径尚未完全阐明，一个很明显的事实是mTOR参与了蛋白质合成的调节，并与生长因子及其受体、细胞周期进程及膜运输相互作用[11]。生长因子激活 PI3k和Akt，然后通过mTOR介导大量蛋白激酶S6k、CDK、4EBP磷酸化，影响肿瘤细胞的存活和增殖[12]。VEGF通过介导激酶链 PI3k-Akt-mTOR调控血管内皮细胞的增生、存活和转移[13]。抑制 mTOR的功能可以消除由 PI3K/Akt通路介导的增殖信号，使细胞周期阻滞，抑制肿瘤生长，因此mTORxxx作为一种抗肿瘤药物的作用最近再次引起关注。目前已有西罗莫司(Sirolimus)和依维莫司(Everolimus)2种商品化抗mTOR的药物。
多靶点xxx治疗
研究表明，Raf/MAPK-ERK激酶(MEK)和细胞外信号调节激酶(ERK)通路在HCC发病过程中有一定作用[14]。此外，HCC细胞系内过度表达的活化MEK1可通过阻止细胞凋亡而促进肿瘤的生长和存活。HCC是一种富血管性肿瘤，VEGF 可促进 HCC的发展和转移。因此，阻断通过Raf/MAPK-ERK的信号传导及VEGF的作用可能会对HCC起到治疗效果[15]。
分子靶向治疗在控制HCC的肿瘤增殖、预防和延缓复发转移以及提高患者的生活质量等方面可能具有独特优势;循证医学高级别证据已充分证明基因治疗药物可以延长晚期HCC患者的生存期，而联合其他治疗药物或方法有可能取得更好的效果。
2、 免疫治疗
目前免疫治疗对临床已生长的实体瘤的消除能力尚十分有限，对大量的肿瘤细胞也难以奏效，在临床上多用于手术、介入等方法的辅助治疗，或不能耐受化疗以及不能手术切除的HCC患者。包括主动免疫、非特异性免疫、过继免疫和联合免疫等。
主动免疫治疗
主动免疫治疗是指利用肿瘤细胞的特异性物质诱导患者产生特异性免疫，进而主动杀伤肿瘤细胞的过程，目前用于临床的PLC主动免疫包括HCC肿瘤疫苗、树突状细胞疫苗。
HCC肿瘤疫苗
是将自身或异体同种HCC细胞经过物理因素(如照射、高温)、化学因素(如酶解)及生物因素(如病毒感染、 基因转移)等的处理，改变或消除其致瘤性，保留其免疫原性，输入体内，刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫，达到治疗PLC、预防HCC转移和复发的目的[16]。人类肿瘤免疫排斥抗原——黑色素瘤抗原家族(melanoma antigens，MAGEs)的发现，为肿瘤的免疫治疗提供了特异性抗原。由于MAGE抗原能被肿瘤组织特异性表达且可与人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)1和HLA2形成抗原肽/HLA复合物，能被杀伤T细胞(cytotoxio T lymphocyte，CTL)识别和杀伤，提示MAGE抗原用于PLC的免疫治疗，开发肿瘤疫苗有着广阔的前景。
树突状细胞疫苗
树突状细胞(dendritic cell，DC)是体内功能最强的专职抗原递呈细胞 (antigen presentinz cell，APC)，可以刺激初始T细胞增殖、诱导初始免疫应答，在抗肿瘤细胞免疫应答中发挥重要作用。肿瘤可使DC功能失常，使之处于非成熟状态。只有成熟的DC才能有效呈递抗原，以诱导机体产生有效的抗癌免疫应答[17]。目前用DC疫苗治疗HCC临床应用报道不多，有待进一步研究和探讨。
非特异性免疫治疗
非特异性免疫治疗的目的：肿瘤相关抗原在恶性肿瘤细胞上的表达比正常细胞高得多，并足以使这些抗原成为有效的攻击目标。另外，可通过激发免疫系统的免疫效应、修饰免疫应答等方法，非特异性地增强机体对肿瘤的免疫排斥能力。
常用非特异性免疫制剂包括：1)生物制剂，主要是重组的细胞因子，如IL、IFN、TNF等，既可单独使用，也可联合应用;2)微生物及其产物，如卡介苗、短小棒状杆菌、混合菌苗、溶链菌和高聚金葡素等;3) 胸腺肽;4)中医药。
过继免疫治疗
过继免疫治疗以输注自身或同种特异性或非特异性肿瘤杀伤细胞为主，不仅可纠正细胞免疫功能低下，而且可直接发挥抗肿瘤作用。包括：淋巴因子激活的杀伤细胞、肿瘤浸润的淋巴细胞、细胞毒性T细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞等。
淋巴因子激活的杀伤细胞
淋巴因子激活的杀伤细胞 (lymphokine activated killer cell，LAK cell)是用高浓度 IL-2激活的肿瘤患者自体或正常供者的外周血单个核细胞，LAK细胞在体外有广谱的抗自体及异基因肿瘤的活性，可直接溶解、杀伤瘤细胞[18]。LAK细胞半衰期短，与 IL-2联合应用，可保持LAK细胞的活性，以保证疗效。IL-2/LAK细胞治疗对PLC根治性切除术后预防复发有较高的价值。
肿瘤浸润的淋巴细胞
肿瘤浸润的淋巴细胞 (tumor infiltrating lymphocyte，TIL)为肿瘤组织分离出的淋巴细胞经IL-2培养而产生，为自体肿瘤特异性杀伤细胞。目前认为，TIL 对肿瘤细胞的杀伤活性较LAK细胞高。
细胞毒T淋巴细胞
细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)为特异性抗原体外诱导单核细胞克隆。CTL需第1信号系统(MHC，TCR)和第2信号系统(共刺激分子如 B7)激活，具有肿瘤杀伤特异性。 Haruta 等[19]报道，对晚期PLC患者而言，CTL的治疗效果要优于LAK细胞。
细胞因子诱导的杀伤细胞
细胞因子诱导的杀伤细胞 (eytokine-induced killer cell，CIK cell)为 MabCD3(抗 CD3单抗)、IL-1、IFN-γ和 IL-2培养的正常人外周血淋巴细胞。来源于CD3+CD56- T淋巴细胞具有广谱的抗肿瘤活性，在动物实验中有较好的治疗效果[20]。
联合免疫治疗
由于肿瘤生物学特性所具有的特殊免疫逃逸机制，导致单一性免疫治疗难以奏效，因此联合治疗成为目前临床免疫治疗的首选。在化疗过程中提高患者免疫力，对抗化疗药物免疫抑制的副作用，起到协同作用。
3 、基因治疗
研究表明，PLC发生有单中心及多中心，且与个体的基因缺陷有关。多基因、多阶段的癌基因或抑癌基因变构为PLC发生、发展的分子基础[21]。PLC的基因治疗是在基因调节水平上进行操作以杀伤或抑制肿瘤细胞的治疗方法。随着DNA 重组技术和转基因方法的不断完善，基因治疗的研究获得了迅猛发展。
抑癌基因 治疗
抑癌基因治疗是将具有正常功能的野生型抑癌基因(如 p53、p66等)通过各种途径转染至肿瘤细胞中，重建失活的抑癌基因功能，恢复细胞的正常生长表型，或者诱导细胞凋亡，从而达到控制肿瘤细胞生长的目的。p53基因是目前研究和应用得最多的一个，不仅可抑制癌细胞生长，还可诱导其凋亡;p16基因能阻抑细胞生长，但不诱发凋亡。p53反义核酸或向细胞内导入 wt-p53的基因治疗，可以抑制肿瘤的增殖，诱导凋亡，提高对药物的敏感性[22]。Okimoto等[23]将带有野生型p53基因的腺病毒载体Adomv p53通过肝动脉注入小鼠RCN-9结肠癌细胞肝转移模型，48 h后，经腹腔注射顺铂(CDDP)，发现转移的PLC细胞广泛凋亡而肝脏功能并未受损。
自杀基因治疗
自杀基因疗法又被称为“病毒介导的酶/前体药物治疗(virus-directed enzyme/prodrug therapy，VDEPT)。原理是把某些病毒、细菌中特有的转换酶基因——自杀基因导入体内后，利用其产生的酶将无毒或低毒的药物前体转成细胞毒性代谢产物，从而杀死肿瘤细胞的基因治疗方法。目前，用于PLC基因治疗的自杀基因系统有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV2TK)基因/无环鸟苷(GVC)系统、胞嘧啶脱氨酶(CD)基因/5-氟胞嘧啶(5-FC)系统和嘌呤核苷酸磷酸酶(PNP)基因/氟达拉滨系统等。Harada等[24]以EB病毒基因组成的质粒载体与非病毒载体PAAD结合成杂交载体介导HSV-TK/GCV系统，能有效治疗实验小鼠PLC。
免疫基因治疗
免疫基因治疗通过基因重组技术增强机体的抗肿瘤免疫功能而达到治疗肿瘤的目的。免疫基因治疗可分为2类: 一种是将细胞因子基因导入PLC细胞，通过增强肿瘤细胞表面肿瘤抗原性、MHC 分子或黏附分子的表达而提高免疫原性;另一种是将细胞因子基因导入免疫活性细胞，如LAK细胞和树突状细胞等，通过直接刺激免疫效应细胞而达到增强免疫反应、抑制肿瘤生长的目的。目前，常用的细胞因子有IL-2、IL-12、IL-18、TNFα、IFN和集落刺激因子等。IL-12是作用较显著的细胞因子之一。Harada等[25]研究发现以IL-12基因治疗免疫抑制状态下的鼠PLC模型，可明显增加肿瘤细胞周围淋巴细胞的浸润并增强肿瘤特异性杀伤细胞的反应;IL-12可显著抑制肿瘤的复发。其他免疫基因治疗还包括IL-12和IL-2联合转染、IL-12和TNF、GM2CSF和IL-2 联合应用等。
反义基因治疗
PLC的发生、 发展 过程中许多癌基因及生长因子的基因产物大量表达，运用反义技术可以抑制这些产物的过度表达，从而抑制肿瘤的生长。根据PLC发病原因，导入反义寡核苷酸封闭PLC基因的表达或用正常抑癌基因取代突变抑癌基因。已报道设计针对VEGF、端粒末端转移酶、c-myc等癌基因的表达途径，诱导PLC细胞凋亡抑制其生长[26]。反义技术的主要缺点是目的基因的靶向性欠佳和半衰期较短，目前一般作为手术和化疗的辅助治疗方法。
联合基因疗法
PLC的发生涉及到多基因参与，因此单用一种基因治疗效果有限。不同的基因治疗策略联合应用可相互协同，增强抗肿瘤效果常采用免疫基因和自杀基因的联合治疗。Drozdz等[27]联合HSV-TK和IL-12治疗效果都明显优于单个基因治疗。
尽管目前有多种细胞因子、抑癌基因等可用于肿瘤的基因治疗，但总体来讲，效果尚不理想，因而寻找更多更具杀伤力的基因将大大推动基因治疗的研究和应用范围。基因治疗尚存在诸多理论上和技术上的问题，如靶向性、基因载体的转移效率、导入基因的持续表达、基因治疗的安全性等问题，还有待进一步完善[28]。
4、 内分泌治疗
在PLC患者中有33%的病例可查出雌激素受体，使用抗雌激素的三苯氧胺治疗PLC已有报道。有学者认为，大剂量口服三苯氧胺可作为逆转多药耐药基因的药物。然而，最近几次大样本的RCT和Meta分析却未发现有统计学意义[29]。
5 、干细胞治疗
干细胞移植现已成为恶性血液病、实体瘤等疾病的根治性方法之一。近年来，已有多个学者研究报道了造血干细胞参与了肝组织的再生和修复过程。它是利用血液成分分离装置处理血液，采取存在于末梢血中的造血干细胞进行移植的手段。由于PLC化疗敏感性较低，以现有水平，行造血干细胞、骨髓移植有一定困难。
6 、结语
总之，经过多年的研究，生物治疗技术已取得了越来越多可喜的成果，并显示出了广阔的应用前景。生物治疗技术在PLC的综合治疗中将发挥越来越重要的作用。我们有理由相信不久的将来，HCC的生物治疗会逐渐过渡成为一种常规的治疗方法,为PLC患者带来福音。
【参考文献】
[1] Daveau M, Scotfe M, Francois A, et al. Hepatocyte growth factor，transforming growth factor alpha，and thEir receptors as combined markers of prognosis in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Carcinog, 2003,36(3):130-141.
[2] Moser GJ, Wolf DC，Goldsworthy TL. Quantitative relationship between transform ing growth factor-alpha and hepatic focalphenotype and progression in female mouse liver[J]. Toxicol Pathol, 1997,25(3):275-283.
[3] Kira S, Nakanishi T, Sumori S, et al. Expression of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor in human hepatocellular carcinoma[J]. Liver, 1997,17(4):177-182.
[4] Decicco L A, Kong J, Ringer DP. Carcinogen-induced alteration in liver epidermal growth factor receptor distribution during the promotion stage of hepatocarcingenesis in rat[J]. Cancer Lett, 1997,111(1-2)：149-156.
[5] Vlahovic G, Crawford J. Activation of tyrosine kinases in cancer[J]. Oncologist, 2003,8(6):531-538.
[6] Kraizer Y, Mawasi N, Seagal J, et al. Vascular endothelial growth factor and angiopoietin in liver regeneration[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001,287(1):209-2l5.
[7] Zhao J, Hu J, Cai J, et al. Vascular endothelial growth factor expression in seFam of patients with hepatocellular carcinoma[J]. Chin Med J(Eng1), 2003,116(5)：772-776.
细菌电泳相关论文范文 篇四
【摘 要
】
生物科学史揭示了科学家科学研究的历程，是人类认识、探索和改造自然的探究史。分析了教师在生物教学中要充分利用生物科学史的趣味性、渐进性、经典性和严谨性，激发学生的学习热情、突破重难点知识，提高探究学习能力，培养科学素养。
【关键词
】生物科学史 生物教学 教学价值
生物科学史全方位地展示了生命科学产生、形成、发展、演变的历程，它包含着实验探索、理论形成的科学规律与方法，每个科研成果的背后也蕴涵着科学家伟大的科学精神与人格魅力。《普通高中生物课程标准》中提出：“学习生物科学史能使学生沿着科学家探索生物世界的道路，学习科学的本质和科学研究的方法，学习科学家献身科学的精神，这对提高学生的科学素养是很有意义的。”在生物教学过程中，教师应该重视生物科学史的教学，以趣味的科学故事激发学生的学习热情，以经典的科学实验帮助学生理解生物学知识和提高探究能力，以科学家严谨务实、一丝不苟的科学态度陶冶学生的科学精神，从而实现生物教学的目的。对此，文章从以下四个方面探讨生物科学史在生物教学中的教学价值。
一、利用生物科学史的趣味性提高学生的学习兴趣，激发其学习热情
在学习生物科学知识的过程中，很多学生会觉得枯燥乏味，甚至深奥难懂，因而对生物学习缺乏兴趣。事实上，生物科学史中不乏逸闻趣事，教师应在课堂上结合教学内容，列举一些有趣的事例，吸引学生的注意力，提高其学习兴趣。爱因斯坦说过：“兴趣是最好的老师”，学生对所学知识产生兴趣，就会提高其学习的积极性，从而提高学习效率。在生物课堂教学中，教师利用生物科学史导入新课，除了能够迅速使学生集中注意、激发认知需求外，还能促使学生形成学习期待。例如，在讲授细胞结构的知识点时，可以向学生讲述英国物理学家和天文学家罗伯特虎克发现细胞的故事来导入;在讲解条件反射知识点时，可以向学生介绍俄国生理学家伊万巴甫洛夫通过观察狗吃食物发现非条件反射的故事等。可见，教师应善于收集一些与生物教学有关的故事情节，在课堂上将生物科学史与生物教学巧妙融合，增加生物学知识的趣味性和故事性，从而激发学生的学习热情，促使其主动学习。
二、利用生物科学史的渐进性理解生物学知识，突破重难点
生物科学史是生命科学研究成果的发现过程，是揭示生命奥秘的过程。在生物教学的过程中，以科学史作为教学材料，能够顺理成章地展现生物科学知识的形成过程，有助于学生全面理解生物学基础知识，构建完整的知识体系，这也符合学生的认知规律。另外，层层递进的科学史知识，能够帮助学生深入地理解生物课堂上的重难点内容。
通过科学史可以全面了解生物科学的具体研究方法和思维方法，从而积累更多的知识经验，拓展学生的思维空间，提升学生突破重难点知识的综合能力。例如，在讲授高中生物《光合作用》的内容时，教师可将光合作用的发现史贯穿在课堂教学中，如讲授光合作用的产物时，可结合1864年德国科学家萨克斯的绿叶遮光实验来讲解;讲授光合作用的场所时，可通过1880年德国科学家恩吉尔曼用水绵实验来讲解;讲授光反应中氧气的来源时，可以结合1939年美国科学家鲁宾和卡门的氧同位素标记的实验来讲解。可见，不同的实验体现了不同的研究方法和思维方法，可加深学生对单一变量、对照等实验原则的理解，以及对同位素标记法等科学研究方法的掌握，从而使生物教学的重难点知识得以突破，提高学生解决问题的综合能力。
三、利用生物科学史的经典性体验科学过程，提高学生的探究能力
生物科学史中的一些经典实验，蕴涵着独特的生物学思维和科学研究方法。利用科学史上的经典实验进行教学，是培养学生探究学习能力的一个有效措施。在生物科学史课堂中，教师要灵活运用科学史，引用科学史资料来导入新课，创设探究情景、营造探究氛围，以发散学生思维，提高其科学探究能力。生物科学发展的历史就是一部科学探究的历史，在教学中可普及一些科学史的知识，让学生从中体验科学探究活动的整个过程。教师把经典的科学探究实验引入生物课堂，让学生身临其境地思考与探索，自主设计实验方案，感悟科学探究过程，理解科学家发现、探索和解决问题的科学精神。例如，在讲授“遗传定律”的内容时，可以融入奥地利生物学家格里哥孟德尔经典豌豆实验的科学史，按照“假设――演绎法”的推理探究模式进行教学，使学生在体验遗传规律探究发现的过程中，不断深化对遗传定律基础知识的认识，掌握科学探究的基本方法，提高探究学习的能力。可见，教师在生物课堂上可以通过具体的科学史实例，让学生亲身体验科学探究的一般过程，即观察科学现象――提出科学假设――设计科学实验――假设的证实或证伪，培养学生的发散思维，提高其探究能力。
四、利用生物科学史的严谨性树立学生的科学观念，培养其科学素养
科学素养包括两个层面：一是对知识、情感和技能的掌握程度，二是在原有的基础上不断提升自身科学素养的能力。新课程改革的理念倡导转变学生的学习方式变被动为主动，提倡学生主动参与、勤于动手、乐于探究，注重培养学生搜集和处理信息的能力、分析和解决问题的能力以及交流与合作的能力，全面提高学生的科学素养。学习生物科学史，就是追寻科学家探索生物奥秘的脚步，深入地理解生物科学的本质和科学研究的方法。生物科学史的故事中蕴涵了科学家的科学态度及精神，例如，青霉素的发现是1928年英国细菌学家弗莱明严谨不苟、求真务实态度的成果;自然选择学说的创立是英国生物学家达尔文合理质疑、勇于创新意识的指引;奥地利生物学家格里哥孟德尔潜心研究了八年的植物杂交实验，最终总结出重要的孟德尔遗传规律，也体现出科学研究需要坚持不懈、一丝不苟的科学精神。在课堂教学中，教师应渗透这些生物科学史教育，有助于学生养成科学态度和科学精神，让学生在理解科学实验的发展过程中，提高学生发现、探索与解决问题的能力。因此说，科学实验的严谨性渗透在科学史中，能够帮助学生树立科学观念，培养其科学素养。
综上，生物科学史中蕴涵着科学家对生命世界探索的精彩片段，有效的生物科学史教学应选择适合的材料、运用恰当的手段，才能达到最佳的.教学效果，让学生身临其境般地感受和领悟科学探索的过程。生物科学史是一部揭示生命科学发展历程的探究史，科学史的学习将知识传授、能力培养和情感态度价值观的发展等三个方面的教育融合起来，其趣味性能够激发学生的学习兴趣，使学生主动地沿着科学家探索生物奥秘的道路去发现与解决问题，真正理解生物科学的本质，感受生物科学蕴涵的精神，从而培养学生的科学思维方法和科学探究能力，促进学生科学而全面的发展，对培养学生的科学素养具有重要作用。
细菌电泳相关论文范文 篇五
摘要 生物芯片是便携式生物化学 分析 器的核心技术。通过对微加工获得的微米结构作生物化学处理能使成千上万个与生命相关的信息集成在一块厘米见方的芯片上。采用生物芯片可进行生命 科学 和医学中所涉及的各种生物化学反应，从而达到对基因、抗原和活体细胞等进行测试分析的目的。生物芯片 发展的最终目标是将从样品制备、化学反应到检测的整个生化分析过程集成化以获得所谓的微型全分析系统(micro total analytical system)或称缩微芯片实验室(laboratory on a chip)。生物芯片技术的出现将会给生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品和环境卫生监督等领域带来一场革命。本文阐述了生物芯片技术在加工制备、功能和 应用 方面的近期 研究 进展。
关键词：生物芯片，缩微芯片实验室，疾病诊断，基因表达
人类基因组计划的目标是在2005年完成对30亿个人体基因组DNA碱基的序列测定，现在通过使用更高级的毛细管阵列测序仪和商业操作，使该计划有望提前完成。因此，人们现已开始利用人类基因组计划中所发现的已知基因对其功能进行研究，亦即把已知基因的序列与功能联系在一起的功能基因组学研究。另外，与疾病相关的研究已从研究疾病的起因向探索发病机理方面转移，并从疾病诊断向疾病易感性研究转移。由于所有上述这些研究都与DNA结构、病理和生理等因素密切相关，因此许多国家现已开始考虑在后基因组时期，研究人员是否能用有效的硬体技术来对如此庞大的DNA信息以及蛋白质信息加以利用。为此，先后已有多种解决方案问世，如DNA的质谱分析法[1]、荧光单分子分析法[2]、阵列式毛细管电泳[3]、杂交分析[4]等。但到 目前 为止，在对DNA和蛋白质进行分析的各种技术中，发展最快和应用前景最好看的技术当数以生物芯片技术为基础的亲和结合分析、毛细管电泳分析法[5]和质谱分析法。此外，在此基础上，通过与采用生物芯片技术和样品制备 方法 (芯片细胞分离技术[6]和生化反应方法(如芯片免疫分析[7]和芯片核酸扩增[8])相结合，许多研究机构和 工业 界都已开始构建所谓的缩微芯片实验室。建立缩微芯片实验室的最终目的是将生命科学研究中的许多不连续的分析过程，如样品制备，化学反应和分离检测等，通过采用象集成电路制作过程中的半导体光刻加工那样的缩微技术，将其移植到芯片中并使其连续化和微型化。这些当年将数间房屋大小的分离元件 计算 机缩微成现在只有书本大小的笔记本式计算机有异曲同工之效。用这些生物芯片所制作的具有不同用途的生化分析仪具有下述一些主要优点，即分析全过程自动化、生产成本低、防污染(芯片系一次性使用)、分析速度可获得成千上万倍的提高、同时，所需样品及化学药品的量可获得成百上千倍的减少、极高的多样品处理能力、仪器体积小、重量轻、便于携带。这类仪器的出现将会给生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品和环境卫生监督等领域带来一场革命。因此，它已广为各国学术界和工业界所瞩目[9]。
1 、生物芯片的微加工制备
生物芯片的加工借用的是微 电子 工业和其他加工工业中比较成熟的一些微细加工(microfabrication)工艺(如：光学掩模光刻技术、反应离子刻蚀、微注入模塑和聚合膜浇注法)，在玻璃、塑料、硅片等基底材料上加工出用于生物样品分离、反应的微米尺寸的微结构，如过滤器、反应室、微泵、微阀门等微结构。然后在微结构上施加必要的表面化学处理，再在微结构上进行所需的生物化学反应和分析。
生物芯片中目前发展最快的要算亲和结合芯片(包括DNA和蛋白质微阵列芯片)。它的加工除了用到一些微加工工艺以外，还需要使用机器人技术。现在有四种比较典型的亲和结合芯片加工方法。一种是Affymetrix公司开发出的光学光刻法与光化学合成法相结合的光引导原位合成法[10]。第二种方法是Incyte pharmaceutical公司所采用的化学喷射法，它的原理是将事先合成好的寡核苷酸探针喷射到芯片上指定的位置来制作DNA芯片的。第三种是斯坦福大学所使用的接触式点涂法。该方法的实现是通过使用高速精密机械手所带的移液头与玻璃芯片表面接触而将探针定位点滴到芯片上的[11]。第四种方法是通过使用四支分别装有A、T、G、C核苷的压电喷头在芯片上作原位DNA探针合成的[12]。
2、 生物芯片举例
生物芯片是缩小了的生物化学分析器，通过芯片上微加工获得的微米结构和生物化学处理结合，便可将成千上万个与生命相关的信息集成在一块厘米见方的芯片上。采用芯片可进行生命科学和医学中所涉及的各种生物化学反应，以达到对基因、抗原和活体细胞等进行测试分析的目的。通过分析可得到大量具有生物学、医学意义的信息。生物化学反应和分析过程通常包括三个步骤：
1、样品制备;
2、生物化学反应;
3、检测和数据分析处理。将其中一个步骤或几个步骤微型化集成到一块芯片上就能获得具有特殊功能的生物芯片，例如用于样品制备的细胞过滤器芯片和介电电泳芯片、用于基因突变检测和基因表达的DNA微阵列芯片和用于药物筛选的高通量微米反应池芯片等。现在，世界各国的科学家们正致力于将生化分析的全过程通过不同芯片的使用最后达到全部功能的集成，以实现所谓的微型全分析系统或缩微芯片实验室。使用缩微芯片实验室，人们可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。
样品制备芯片
针对DNA分析，其制备过程通常要经过细胞分离、破胞、脱蛋白等多方面的工作，最后得到纯度足够高的待检DNA。目前在细胞分离方法上较突出的有过滤分离(根据生物颗粒的尺寸差异进行分离)和介电电泳分离(利用在芯片上所施加的高频非均匀电场使不同的细胞内诱导出偶电极，导致细胞受不同的介电力作用，而从样品中分离出来)等;芯片中的破胞方法有芯片升温破胞、变压脉冲破胞，以及化学破胞等。在捕获DNA方面，CephEid公司应用湿法蚀刻和反应离子蚀刻/等离子蚀刻等工艺在硅片上加工出含有5000个高200微米直径20微米的具有细柱式结构的DNA萃取芯片，专门用于DNA的萃取[13]。
生物化学反应芯片
由于目前所用检测仪器的灵敏度还不够高，因此从样品中提取的DNA在标记和应用前仍需用PCR这样的扩增复制技术复制几十万乃至上百万个相同的DN段。
目前，在芯片中进行核酸扩增反应获得成功的有宾夕法尼亚大学研究小组[8，14]，美国劳伦斯-利物摩国家实验室[15]和Perkin-Elmer公司[16]。宾夕法尼亚大学研究小组所做的扩增反应都是在硅-玻璃芯片中进行的，芯片的外部加热和冷却采用的是计算机控制的帕尔帖电-热器。在对芯片表面进行惰性处理后，亦即在硅片表面生长一层2000埃的氧化硅之后，他们成功地在硅-玻璃芯片中完成了一系列不同的核酸扩增反应，例如RT-PCR、LCR、多重PCR和DOP-PCR。由劳伦斯-利物摩国家实验室加工的硅芯片所采用的加热方式是芯片内置的薄膜多晶硅加热套，其升降温的速度很快。Perkin-Elmer公司的PCR反应则是在塑料芯片上完成的。伦敦帝国理工大学的研究者研制了一种样品可在不同温度的恒温区间内连续流动的PCR芯片[17]。上述所有工作都是用事先提纯了的DNA或RNA作为扩增反应的底物来完成的。为了将样品制备和扩增反应集成为一体，宾夕法尼亚大学研究小组最近成功地在坝式微过滤芯片中直接对分离所得的人白细胞通过升温方式胞解后所释放的DNA进行了扩增，这是世界上首例将样品制备和扩增反应集成为一体的研究成果[14]。
检测芯片
毛细管电泳芯片
芯片毛细管电泳是1983年由杜邦公司的Pace开发出来的[18]。随后，瑞士的Ciba-GEIgy公司和加拿大的Alberta大学合作利用玻璃芯片毛细管电泳完成了对寡核苷酸的分离[19]。首次用芯片毛阵列电泳检测DNA突变和对DNA进行测序的是由加利福尼亚大学伯格利分校Mathies领导的研究小组完成的[20,21]。通过在芯片上加上高压直流电，他们在近两分钟的时间内便完成了从118bp到1353bp的许多DN段的快速分离。此外，Mathies的小组与劳伦斯-利物摩国家实验室Nothrup的研究小组合作，报道了首例将核酸扩增反应与芯片毛细管电泳集成为一体所作的多重PCR检测工作[22]。宾夕法尼亚大学Wilding的小组与Ramsey的小组一道用芯片毛细管电泳对芯片中扩增得到的用于杜鑫-贝克肌萎缩诊断的多条DN段进行分离也获得了成功[14]。其他用 芯片毛细管电泳检测突变的外国公司和学术机构有Perkin-Elmer公司、Caliper technologies公司、Aclara biosciences公司和麻省理工等。
DNA突变检测芯片
dNA之所以能进行杂交是因为核苷A和T、G和C可同时以氢键结合互补成对。许多经典的分子生物学方法如桑格DNA测序法和PCR等都是以此为基础的。最近出现的几项技术，如用光刻掩膜技术作光引导原位DNA合成[23]、电子杂交技术[24]、高灵敏度激光扫描荧光检测技术[25]等，使以杂交为基础的应用有了长足的改善。最近的一些 英文 权威刊物对应用芯片杂交技术检测突变作了报道。Hacia等人采用由96000个寡核苷酸探针所组成的杂交芯片，完成了对遗传性乳腺癌和卵巢肿瘤基因BRCA1中外显子上的24个异合突变(单核苷突变多态性)的检测。他们通过引入参照信号和被检测信号之间的色差分析使得杂交的特异性和检测灵敏度获得了提高[26]。另外，Kozal等人用高密度HIV寡核苷酸探针芯片对HIV病株的多态性作了分析[27]。Cronin等人用固化有428个探针的芯片对导致肺部囊性纤维化的突变基因进行了检测[28]。用生物芯片作杂交突变检测的美国公司有贝克曼仪器公司、Abbot laboratory、Affymetrix、Nanogen、Sarnoff、Genometrix、Vysis、Hyseq、Molecular dynamics等;英美学术机构有宾夕法尼亚大学、贝勒医学院、牛津大学、Whitehead institute for Biomedical Research，海军研究室，Argonne国家实验室等。
通过杂交分析DNA的另一应用技术是重复测序。那么，重复测序是怎么工作的呢?首先，人们将长度为8-20个核苷的探针合成并固定到指甲盖大小的硅芯片或玻璃芯片上。当含有与探针序列互补的DNA被置于联有探针的芯片之后，固化探针就会通过与其序列互补的DN段杂交而结合[10]。通过使用带有计算机的荧光检测系统对“棋盘”每个格子上的荧光强弱及根据每个格子上已知探针的序列进行分析与组合就可得知样品DNA所含有的碱基序列。最近美国的Science杂志对应用芯片杂交技术测序作了报道。Chee等人在一块固化有135000个寡核苷酸探针(每个探针长度为25个核苷)的硅芯片上对长度为的整个人线粒体DNA作了序列重复测定。每个探针之间的空间间隔为35微米。测序精度为99%。另外Hacia还报道了一种微测序分析法(minisequencing-based assays)为检测所有可能的碱基序列变化提供了强有力的手段。此方法中需要将不同颜色荧光染料标记的四种ddNTP，加入到引物的酶促反应中，微阵列上固化的寡核苷酸用作酶促反应的引物，靶序列作为模板，可检测到靶序列上的碱基变化。用生物芯片从事杂交测序的美国公司有Affymetrix和Hyseq[29]。
用作基因表达分析的DNA芯片
随着人类基因组计划的顺序进行，越来越多的能够表达的人基因序列以及引发疾病和能预测疾病的各种突变正在为人们逐渐认识。为了能够同时对多个可能的遗传突变进行搜寻、加快功能基因组学研究的进程，人们现已把越来越多的注意力放到了能同时提供有关多个基因及其序列信息的所谓并行分子遗传学分析(parallel molecular genetic analysis)方法上。功能基因组学所研究的是在特定组织中、发育的不同阶段或者是疾病的不同时期基因的表达情况。因此它的要求是要能在同一时刻获得多个分子遗传学分析的结果。譬如，许多疾病引发基因可能会有数以百计的与表征有关的特定突变，因而，要求能有同时筛检这些突变的有效方法。另外，任何一个细胞中都会有上千个基因在表达。而细胞间基因表达的差异往往能反应出这些细胞是发育正常还是在朝恶性肿瘤细胞方向发展。采用芯片技术利用杂交对基因表达进行分析的好处是它能用很少的细胞物质便能提供有关多基因差异表达的信息，从而给疾病诊断和药物筛选提供前所未有的信息量[30]。Lockhart等人采用固化有65000个不同序列的长度为20个核苷的探针芯片，定量地分析了一个小鼠T细胞线中整个RNA群体内21个各不相同的信使RNA。这些专门设计的探针能与114个已知的小鼠基因杂交。分析发现 在诱发生成细胞分裂后，另外有20个信使RNA的表达也发生了改变。检测结果表明该系统对RNA的检出率为1:300000，对信使RNA的定量基准为1:300[32]。Wang等人在研究表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(etoposide)诱导的细胞程序性死亡时，利用DNA芯片技术，制备了一次可检测6591种人细胞信使RNA的寡聚核苷酸微阵列，检测到诱导后的细胞内有62种信使RNA的量发生了变化。通过挑选12个与诱导作用有关的基因作进一步研究，它们发现了2个新的p53靶基因[33]。DeRisi等人将一个恶性肿瘤细胞线中得到的870个不同的cDNA探针通过机械手“刷印”至载玻片上以观察癌基因的表达情况。在比较两个标有不同荧光标记的细胞信使RNA群的杂交结果之后，他们对引入正常人染色体后肿瘤基因受到抑制的细胞中的基因表达结果进行了分析[34]。另外，Shoemaker等人报道了一种利用生物芯片来确定许多新近发现的酶母基因的生物功能的所谓分子条形编码技术。这种技术的好处是它能让我们以并行的方式定量地分析很复杂的核酸混合物[35]。Lueking等人最近采用蛋白质微阵列技术，把作为探针的蛋白质高密度地固定在聚双氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride)上，并检测到了10pg的微量蛋白质测试样。对92个人cDNA克隆片段表达的产物进行检测，用单克隆技术作平行分析，证实了假阳性的的检出率低。由于蛋白质微阵列技术不受限于抗原-抗体系统，故能为高效筛选基因表达产物及研究受体-配体的相互作用提供一条新的有效途径[36]。
缩微芯片实验室
生物芯片 发展的最终目标是将从样品制备、化学反应到检测的整个 分析 过程集成化以获得所谓的微型全分析系统或称缩微芯片实验室。1998年6月，Nanogen公司的程京博士和他的同事们首次报道了用芯片实验室所实现的从样品制备到反应结果显示的全部分析过程。他们用这个装置从混有大肠杆菌的血液中成功地分离出了细菌，在高压脉冲破胞之后用蛋白酶K孵化脱蛋白，制得纯化的DNA，最后用另一块 电子 增强的DNA杂交芯片分析证实提取物是大肠杆菌的DNA。这是向缩微实验室迈进的一个成功的突破[37]。 目前 ，含有加热器、微泵微阀、微流量控制器、电子化学和电子发光探测器的芯片已经研制出来了，而且，也出现了将样品制备、化学反应和分析检测部分结合的芯片(例如，样品制备和PCR[38];竞争免疫测定和毛细管电泳分离[39])。相信不久的将来，包含所有步骤的缩微芯片实验室将不断涌现。
3 、结尾
经过近十年的不懈努力，生物芯片技术发展至今已经开始对生命 科学 研究的许多领域带来冲击甚至革命。以美国为首的西方发达国家在该领域已经取得了令人眩目的成就。到现在，从样品制备、化学反应到检测的三个步骤已获得了部分集成，三个部分的全部集成已初现端倪。 中国 在这方面尚未起步，如果各方面重视，投入一定的人力和物力，相信不久的将来在该领域中我们也会占有一席之地的。
参考文献
1 Koster H,et Biotechnology,1996;14:1123-1128.
2 Wilkerson CW,et Physics Letter,1993;62:2030-232.
3 Hang XC,et Chemistry,1992;64:2149-2154.
4 Southern EM,et in Genetics 1996;12:110-118.
5 Pennisi E,Science 1996;272:1737.
6 Kricka LJ,et of International Federation of&nbs p;Clinical Chemistry1994;6:54-59.
7 Kricka LJ,et al. Microfabricated Immunoassay Devices. In Principles & practice of Immunoassay (2ndEdition).Edited by Price CP and Newman DJ, Macmillan press,London,1996.
8 Cheng J,et Acids Research 1996;24:380-385.
9 Manz A,Chimia 1996;50:140-143.
10 Cheng J,Molecular Diagnosis 1996;1:183-200.
11 Cheng J,et preparation in microstructured devices, in Manz a,Bechar H.(eds)“Microsystem technology in Chemistry and life Scence”,a special volume in 12 Topics in current Chemistry Springer,HEIdelberg,1998;215-231.
13 Markx G H,et ;140:585-591.
14 Northrup MA,et of Transducers’95, the Eighth International conference on Solid-State Sensors and Actuators 1995;764-765.
15 Cheng J,et Biochemistry 1998;257/2:101-106.
nothrup MA,et of the 8thInternational Conference on Solid-State Sensors and actuators, and Eurosensors IX, 1995; 764-767.
16 Taylor TB, et Acids Research 1997;25:3164-3168.
17 Mrtin UK, et 1998;280:1046-1048.
18 Pace SJ,US Patent 4,908,112,1990.
19 Manz A,et ;593:253-258.
20 Wooley aT,et ;91:11348-11352.
21 Woolley AT,et ;68:4285-2186.
22 Woolley AT,et ;68:4081-4086.
23 Fodor SPA ,et ;251:767-773.
24 Sosnowski RG,et ;94:1119-1123.
25 Kreiner t.,Rapid genetic sequence analysis using a DNA probe array .
26 Hacia JG,et Genet,1996;14:441-447.
27 Kozal MJ,et Medicine,1996;2:753-759.
28 Cronin MT,et Mutation,1996;7:244-255.
29 Cheng J,et Diagnosis,1996;1:183-200.
30 Hacia J G,Nature genetics supplement,1999;21:42-47.
31 Scangos G,Nature Biotechnol,1997;15:1220-1221.
32 Lockhart DJ,Nature Biotechnol,1996;14:1675-1680.
33 Wang Y,et Letter,1999;445:269-273.
34 DeRisi J,et Genet,1996;14:457-460.
35 Shoemaker DD, et Genet, 1996;14:450-456.
36 Lueking A, et Biochem,1999;270:103-111.
37 Cheng J,et Biotechnology,1998;16:541-546.
38 Wilding P,et ;257:95-100.
3 9 McCormick RM,et ;69:2626-2630
细菌电泳相关论文范文 篇六
摘要：
为探讨栀子(Gardenia jasminoides)果实中藏花素的合成机理，克隆了栀子类胡萝卜素生物合成的关键酶八氢番茄红素合成酶(GjPSY)基因的全长 cDNA。结果表明，推导的 GjPSY 氨基酸序列与双子叶植物来源的 GjPSY 亲缘关系较近。采用HPLC 检测栀子果实中的藏花素-1 含量为( ± ) mg g–1，在叶片中未检出。通过 RT-PCR 分析表明，GjPSY在栀子叶片和果实中均有表达，且表达水平一致。因此推测，GjPSY的转录水平与果实中藏花素-1 的合成无关。
关键词：
栀子;阿朴类胡萝卜素;藏花素;八氢番茄红素合成酶;基因表达
1、 材料和方法
材料和试剂栀子(Gardenia jasminoides)植株培养于广东药学院。采集栀子成熟叶片和花后 16 周的栀子果实，果肉为橙色。所有材料贮存于 –80℃。CreatorTMSMARTTMcDNA 文库构建试剂盒购自 Clontech公 司。Primescript one step RT-PCR 试 剂 盒 购 自TaKaRa 大连公司。藏花素-1 (Crocin-1)的对照品购于 Sigma-Aldrich 公司。乙腈、甲醇为色谱纯，其它生化试剂等为分析纯。
藏花素-1含量的测定以改良的 HPLC测定栀子叶片和果实中藏花素-1 (Crocin-1)的含量。叶片和果实在液氮中研磨后以 50% (V/V)的甲醇-水溶液提取，在超声处理 30 min 后以 10000 ×g离心 10 min，取上清液在 –20℃下贮存。HPLC 分析时，上清液以 μm滤 膜 过 滤，以 DiamonsilTMC18 (2) 柱(250 mm × mm, 5 μm)(Dikma 公司，中国)分析，梯度洗脱。
仪器为 Waters 2995 HPLC 仪(Waters 公司 , 美国)，配备 2996 光电二极管阵列检测器检测。数据分析图 1 Crocin 的生物合成途径。IPP：异戊烯焦磷酸 ; DMAPP：二甲基丙烯焦磷酸;GPP：香叶基焦磷酸;GGPP：香叶基香叶基焦磷酸。Fig. 1 Biosynthesis pathway of crocin. IPP: Isopentenyl diphosphate; DMAPP: Dimethylallyl diphosphate; GPP: Geranyl diphosphate; GGPP:
Geranylgeranyl pyrophosphate.第5期 441以 Empower 2 软件完成。洗脱条件为：10% ~ 20%乙腈溶液(乙腈 / 水，V/V)，0 ~ 20 min;20% ~ 50%乙腈溶液，20 ~ 25 min，流速为 1 mL min–1，检测波长 440 nm。目标峰通过与藏花素-1 对照品的保留时间和吸收光谱的比较而确定。通过标准曲线确定藏花素-1 的含量，共进行 3 次重复实验。
GjPSY基因的克隆以 CTAB (Hexadecyl trimethyl ammoniumbromide)法提取栀子果实中的总 RNA。按照CreatorTMSMARTTMcDNA 文库构建试剂盒的说明书从总 RNA 构建栀子果实的 cDNA 文库。将获得的 SMART 双链 cDNA 克隆接入 pDNR-LIB 载体并转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH-5α。
根据植物八氢番茄红素合成酶基因PSY的保守区设计简并引物，F1：5′-ATHTGGGCNATHTAY-GTNTGG-3′ 和 F2：5′-RAARTTRTTRTARTCRTTN-GCYTC-3′，从 cDNA 文库的细菌裂解液中扩增PSY基因。获得了GjPSY基因的中间片段，将该片段回收并测序，命名为GjPSY-M。根据GjPSY-M片段序列分别设计 5′ 端特异引物 GSP1：5′-GCGATA-CAACAATAGCGATGCCCATACAG-3′ 和 3′ 端 特异引物 GSP2：5′-GTGCAGGAGAACGGATGAGC-TGGTT-3′，配合文库构建试剂盒提供的 5′ 端和 3′端的质粒检测通用引物，采用 RACE 方法从 cDNA文库中获得GjPSY基因的 5′ 端和 3′ 端序列。获得的片段分别命名为5′GjPSY和3′GjPSY，将片段回收和测序并进行序列分析，与GjPSY-M拼接出GjPSY的全长 cDNA。根据全长GjPSY序列，经过 BLAST比对和开放阅读框(ORF)序列分析，分别设计引物 F1：5′-CGCCATTAATATGTCTGTCGCTTTGC-TATGGGTTG-3′和 F2：5′-ATGCTCGAGGGCCTT-TGCTAGTGGAGATGATGTTCT-3′，从 cDNA 文库的细菌裂解液中扩增得到GjPSY的 ORF 序列。
GjPSY基因的表达分析从栀子果实和叶片中分别提取总 RNA，采用Primescript one step RT-PCR 试剂盒进行 RT-PCR分析，反应所用GjPSY特异引物分别为F1：5′-GAC-ATACTTGCTGGAAAGGTCAC-3′ 和 F2：5′-GCTA-GTGGAGATGATGTTCTTGG-3′。以组成性表达的RPS25-1基因(40S 核糖体小亚基蛋白 25-1 基因，GenBank 登录号：GU797554)为内参，RPS25-1基因的特异引物分别为 F1：5′-CAGAAGAAGAAGA-AGTGGAGCAA-3′ 和 F2：5′-TGGTAGCTCTGGT-GTATATCTGC-3′。RT-PCR 反应程序为：95℃ 2 min，接着94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30次循环，最后 72℃延伸 7 min。扩增产物用 琼脂糖凝胶电泳检测。
2、 结果
栀子叶片和果实中藏花素-1的含量使用甲醇-水溶液提取栀子叶片和果实中的藏花素-1，提取液用于 HPLC 分析。通过与 crocin-1对照品的保留时间和吸收光谱进行比较，在果实样品中观察到 crocin-1 峰，在叶片样品中未观察到crocin-1 峰(图 2)。同时，检测到果实中 crocin-1 的含量为( ± ) mg g–1。
GjPSY基因的克隆为了克隆GjPSY基因，构建了栀子果实的cDNA 文库，以简并引物从 cDNA 文库中扩增得到GjPSY基因 cDNA 的中间片段GjPSY-M，长度为688 bp。接着通过 5′ RACE 获得了长度为 1596 bp的5′GjPSY片段;通过 3′RACE 获得了长度为 956bp的3′GjPSY片段。将5′GjPSY、GjPSY-M和3′GjPSY共 3 个片段序列进行拼接，得到全长 cDNA，长度为 1876 bp。根据全长序列从 cDNA 文库中扩增得到 ORF 序列(图 3);经序列分析，此全长 cDNA 含有 1314 bp 的 ORF，5′ 端非翻译区为 393 bp，3′端非翻译区为 169 bp，命名为GjPSY (GenBank登陆号：HQ599860)。预测GjPSY基因编码的蛋白质含有 437 个氨基酸，分子量为 kDa，等电点为。
GjPSY的序列分析GjPSY 的氨基酸序列经 BLAST 分析，结果表明，GjPSY 与多种植物的八氢番茄红素合成酶的序列相似，它们均含有两个保守的富含天冬氨酸的模体 DXXXD。这个模体被认为可通过 Mg2+结合于底物的焦磷酸基团，在八氢番茄红素合成酶催化两个 GGPP 分子缩合的反应中发挥重要作用。
采用 ClustalW2 软件对相似度较高(相似度为 55% ~ 93%)的18 条来自多种植物的八氢番茄红素合成酶序列进高蓝等：栀子八氢番茄红素合成酶基因的分离及表达分析442 热带亚热带植物学报第21卷行同源进化比对，采用 Mega 软件构建氨基酸序列的 NJ (Neighbor-joining)系统进化树，用重复1000 次的自展支持率(Bootstrap)检验各分支的置信值。结果表明，GjPSY 与中粒咖啡的 PSY最为相似，与番茄和拟南芥 PSY 的相似度均大于来自禾本科的玉米及水稻的。而在与玉米和水稻的各 3 种 PSY 的比对中可知，GjPSY 与 PSY1 最为相似，而与 PSY3 关系最远。
GjPSY的表达分析分别提取栀子叶片及果实中的总 RNA，采用RT-PCR 法分析GjPSY的表达水平。以组成性表达的RPS25-1为内参。结果表明，GjPSY的转录水平在叶和果实中表现一致。
